SARS-CoV-2 v odpadních vodách

Požadavky Evropské komise na zavedení systematického monitoringu SARS-CoV-2 v odpadních vodách jsou čeští výzkumníci připraveni splnit

Evropská komise vyzvala v dokumentu Doporučení Evropské komise na zavedení systematického monitoringu SARS-CoV-2 v odpadních vodách ze dne 17. 3. 2021 (dostupné zde) členské státy k zavedení monitoringu viru SARS-CoV-2 v nečištěných odpadních vodách v čistírnách odpadních vod za účelem určení úrovně výskytu koronaviru SARS-CoV-2 v populaci nebo v zájmové komunitě a nastavení systému včasného varování pro trvalý epidemiologický monitoring.

Od dubna 2020 se Výzkumný ústav vodohospodářaský T. G. Masaryka, v. v. i. (VÚV TGM), ve spolupráci s Výzkumným ústavem veterinárního lékařství, v. v. i. (VÚVeL), zabývá problematikou stanovení koronaviru SARS-CoV-2 v odpadních vodách s cílem vytvoření funkčního a efektivního systému včasného varování před nástupem epidemie a následné sledování jejího průběhu pro účely nastavování účinných opatření k regulaci epidemie. Detekce přítomnosti viru SARS-CoV-2 v odpadních vodách je prováděna pomocí RT-qPCR analýzy. V současné době je možné s využitím vlastní optimalizované metodiky stanovení koronaviru SARS-CoV-2 detekovat jednotky nakažených obyvatel napojených na ČOV středně velkého města. Čeští výzkumníci na základě dosavadních zkušeností nabízejí návrh řešení a realizaci epidemiologického monitoringu podle doporučení EK v podmínkách ČR.

Pilotní monitoring přítomnosti koronaviru SARS-CoV-2 v odpadních vodách byl ve VÚV TGM zahájen na jaře 2020 záhy po zjištění výskytu koronaviru SARS-CoV-2 v České republice a pokračoval na podzim 2020 během druhé vlny epidemie. Během této doby bylo odebráno přes 450 vzorků odpadních vod z přibližně 50 ČOV z celé České republiky. Z toho bylo již analyzováno více než 130 vzorků z jarní vlny epidemie, pozitivní výsledek výskytu koronaviru SARS-CoV-2 byl zjištěn u 15 % z nich. To ukazuje na vysokou citlivost metody, s ohledem na velmi nízké procento pozitivních osob z počtu obyvatel napojených na příslušnou ČOV.

Velmi důležitým prvkem zvoleného přístupu je, kromě optimalizace vzorkování a metodiky analýz, především metodika pro správnou interpretaci výsledků – způsob, jak modelovat pomocí dat získaných ze stanovení SARS-CoV-2 v odpadní vodě šíření onemocnění v populaci nebo zájmové komunitě. Zde je třeba zohlednit rozdíly mezi typy a charakterem spádové oblasti kanalizační sítě čistíren odpadních vod. Tyto parametry mohou interpretaci výsledků významně ovlivňovat.

Obdobná testování jsou prováděna výzkumnými týmy v mnoha zemích světa, do mezinárodních aktivit je zapojen i VÚV TGM, přičemž je také v kontaktu s dalšími subjekty aktivními v dané problematice v ČR (VÚVeL, SZÚ, SOVAK, VŠCHT aj.).

V současné době je ve spolupráci VÚV TGM, VÚVeL a 1. LF UK řešen projekt Využití monitoringu odpadních vod jako nástroje včasného varování před vznikem epidemiologické situace (COVMON, identifikátor VI04000017) podpořený z Programu bezpečnostního výzkumu České republiky v letech 2015 až 2022 (BV III/1-VS), jehož cílem je vypracování Metodiky využití monitoringu rizikových biologických agens a biomarkerů v komunálních odpadních vodách jako nástroje pro včasné epidemiologické varování a optimalizace analytického postupu v Metodice detekce vybraných rizikových mikrobiologických agens pomocí PCR v odpadních vodách.

Průběžné výsledky byly publikovány:

Časopis SOVAK – odesláno do tisku 12. 3. 2021: Hana Mlejnková, Kateřina Sovová, Lucie Jašíková, Petra Vašíčková, Věra Očenášková, Lucia Gharwalová, Alena Fialová, Eva Juranová: MONITORING KORONAVIRU SARS-COV-2 V ODPADNÍCH VODÁCH V ČR PRO VYUŽITÍ V SYSTÉMU VČASNÉHO PROTIEPIDEMICKÉHO VAROVÁNÍ

MLEJNKOVÁ, H., SOVOVÁ, K., JAŠÍKOVÁ, L., VAŠÍČKOVÁ, P., OČENÁŠKOVÁ, V., JURANOVÁ, E., FIALOVÁ, A. (2021): Koronavirus SARS-CoV-2 v odpadních vodách v ČR. In: Říhová Ambrožová, J., Petráková Kánská, K. Vodárenská biologie 2021, Praha 10. - 11. 2. 2021, s. 33-40. ISBN 978-80-88238-19-5.

MLEJNKOVÁ, H., SOVOVÁ, K., OČENÁŠKOVÁ, V., JURANOVÁ, E., JAŠÍKOVÁ, L., VAŠÍČKOVÁ, P. a FIALOVÁ, A. (2021) Monitoring koronaviru SARS-CoV-2 v odpadních vodách – co nám dosud ukázal a kam směřuje. Vodohospodářské technicko-ekonomické informace, 63/1, str. 50–52. ISSN 0322-8916.

Mlejnkova, H.; Sovova, K.; Vasickova, P.; Ocenaskova, V.; Jasikova, L.; Juranova, E. Preliminary Study of Sars-Cov-2 Occurrence in Wastewater in the Czech Republic. Int. J. Environ. Res. Public Health 2020, 17, 5508.

Vašíčková, P., Žák, V., Hrdý, J., Krásna, M., Krzyžánková, M. (2020) Virová agens v odpadních vodách a projekt SOVAK při testování. časopis SOVAK č. 12/2020, 17-21.

Vzorkování odpadních vod

Vzorkování odpadních vod

Vzorkování odpadních vod

Vzorkování odpadních vod

Praha, 30. 3. 2021

Monitoring výskytu koronaviru SARS-CoV-2 v odpadních vodách – co nám dosud ukázal a kam směřuje

Ve VÚV TGM, v. v. i., je od dubna 2020 prováděn monitoring přítomnosti koronaviru SARS-CoV-2 v odpadních vodách. Metoda průkazu je obdobná jako u klinických vzorků, tj. pomocí PCR je zjišťována přítomnost specifického fragmentu virové RNA. Významný rozdíl je v náročnosti úpravy vzorku odpadní vody, kdy je z ní nutné separovat čistou RNA s minimalizací ztrát jejího cílového množství. Analýzy provádí virologická laboratoř Výzkumného ústavu veterinárního lékařství (VÚVeL, v. v. i.) v Brně, která má s detekcí virů v odpadních vodách dlouholeté zkušenosti. Stejný monitoring na vybraných ČOV byl prováděn v jarním období společností SOVAK, která zjištěná data poskytla do společného hodnocení. Vyhodnocení je prováděno ve spolupráci se Státním zdravotním ústavem (SZÚ), který ze zdravotnického sektoru zajistil údaje o počtech infikovaných osob v monitorovaných oblastech. V prvním kole monitoringu bylo odebráno celkem 137 vzorků nátoků na 40 ČOV z celého území ČR. Pozitivní nález specifického fragmentu viru SARS-CoV-2 byl zjištěn u 28 % ČOV v 15 % vzorků.

V současné době probíhá vyhodnocení jarního kola odběrů s využitím údajů o počtech infikovaných osob v konkrétních oblastech, které byly v průběhu monitoringu nedostupné. Data o osobách pozitivních na SARS-CoV-2 jsou získána z celostátního systému ISIN (Informační systém infekčních nemocí). Data do ISINu jsou vkládána z Krajských hygienických stanic. Ke grafickému zobrazení epidemiologické situace bylo využito datum prvních příznaků a předpoklad, že člověk je infekční až 3 dny před tímto datem a nejvíce viru vylučuje do 10. dne od prvních příznaků. U některých osob vylučování probíhá déle než 10 dní, což je v grafech zobrazeno slabší barvou. Délka se odvíjí od toho, zda je známo datum negativního PCR testu, pokud ne, je řada ukončena po 30 dnech. Pokud osoba zemřela, řada končí datem úmrtí. Grafy zobrazují výsledky monitoringu odpadních vod v konkrétních datech.

Monitoring pokračuje podzimním kolem odběrů vzorků odpadních vod, aby byly získány informace z druhé vlny epidemie, kdy jsou počty infikovaných osob řádově vyšší než v jarním období. Podíl infikovaných osob na počtu obyvatel napojených na sledované ČOV se na jaře pohyboval kolem 0,1 %, v podzimní vlně je to cca 2 %.

Za účelem zachycení nástupu další vlny zvýšeného výskytu onemocnění COVID-19 byla ze 40 sledovaných ČOV vybrána jedna středně velká ČOV, na níž je od dubna 2020 kontinuálně prováděn monitoring s frekvencí odběrů 1-2 týdny. Na této ČOV byla přítomnost virových fragmentů v jarním kole monitoringu prokázána ve 3 z 8 odběrů. Záchyt odpovídal 3–25 evidovaným infikovaným osobám z více než 20 000 napojených obyvatel. V oblasti napojené na tuto ČOV bylo v době první vlny (do 7. 7. 2020) evidováno cca 60 infikovaných osob, tj. cca 0,3 % napojených obyvatel. V podzimní vlně zde počet infikovaných osob stoupl na cca 2 % (více než 400 osob). Pozitivní nález virové RNA v odpadní vodě zde od jarní vlny nebyl zachycen. Příčinou může být rozdíl v průběhu nemoci v jarní a podzimní vlně, a tedy s možným menším množstvím virových částic obsažených ve stolici nebo moči v lokalitě s intenzivním výskytem v jarní vlně.

Dosavadní výsledky výzkumu nám potvrdily informace publikované na začátku pandemie nizozemskými výzkumníky o výskytu virových fragmentů viru SARS-CoV-2 v nečištěných odpadních vodách. Jak vyplývá z klinických studií, je jejich pravděpodobným zdrojem trávicí a vylučovací systém člověka. Téma přítomnosti koronavirů ve střevech a moči však není dosud dostatečně klinicky probádáno, ale výzkum intenzívně pokračuje. Významný objev udělali vědci z Hubrechtova institutu v Utrechtu, kteří výzkumy na tkáňových kulturách potvrdili, že viry SARS-CoV-2 mohou infikovat buňky střev a množit se v nich. Tímto poznatkem se významně zvyšuje význam monitoringu odpadních vod a studium možné kontaminace vodního prostředí. Průkaz přenosu fekálně-orální cestou však dosud prokázán nebyl. Zatím nejsou známy údaje, zda se v tělních exkretech vyskytují fragmenty viru u všech infikovaných osob, nebo zda záleží na průběhu a symptomech, v jakém množství, po jak dlouhou dobu, v které fázi nemoci a zda i u bezpříznakových jedinců. Důležitá je také konkrétní imunitní odpověď infikované osoby, která může probíhat různými mechanismy, z nichž některé mohou genom viru rozložit až na nedetekovatelné fragmenty. Lze tedy předpokládat, že neexistuje přímá úměra mezi počtem infikovaných osob a kontaminací odpadních vod virovými fragmenty.

Výsledky první vlny monitoringu přinesly, díky celkově velmi nízkému počtu infikovaných osob v ČR v první vlně epidemie, jedinečné výsledky, neboť umožnily zachytit dolní mez detekce zvolené metody. Pozitivní nález fragmentů SARS-CoV-2 byl stanoven u ČOV, kde byly aktuálně v daný den evidovány 1-3 infikované osoby z objemu odpadních vod od 6 000 do 12 000 napojených obyvatel. Vzhledem k předpokládanému časovému intervalu mezi hlášením infekce a potenciálním vylučováním virů do odpadních vod je zde vhodnější jako možné maximum použít kumulativní údaj o počtu infikovaných osob v dané lokalitě za celé jarní období (do 7. 7. 2020). Také v tomto případě byly v odpadních vodách zachyceny fragmenty virové RNA již od 3-5 infikovaných osob z objemu odpadních vod od 6 000 do 80 000 napojených obyvatel. Tato velmi nízká čísla ukazují na velmi vysokou citlivost metody. Při interpretaci dat je nezbytné vzít v úvahu další zjištěná fakta a souvislosti, která budou významná při návrhu systematického epidemiologického sledování odpadních vod.

Prvním faktem je zjištěná absence viru v odpadních vodách v lokalitách, kde byl evidován výskyt pozitivně testovaných osob (obr. 1). Příčinou může být velké naředění odpadních vod, tj. hledaná částice genomu nebyla do vzorku zachycena v detekovatelném množství nebo stavu (došlo např. k degradaci RNA pomocí enzymů štěpících RNA již před odběrem nebo při transportu vzorku). Dalším důvodem může být fakt, že se virové částice nedostaly do trávicího nebo vylučovacího systému infikovaných osob, jak bylo popsáno výše, nebo, že se v době nemoci tyto osoby nevyskytovaly v místě, kde byly evidovány jako infikované (pobyt v zaměstnání, v rekreačních objektech apod.).

Druhým zajímavým faktem je pozitivní nález virových fragmentů v odpadních vodách v lokalitách, kde nebyly hlášeny žádné infikované osoby (obr. 2). Tento případ lze vysvětlit přítomností neevidovaných infikovaných osob, tj. buď bezpříznakových, nenahlášených nebo evidovaných v jiném místě, než na jakém skutečně pobývaly.

Obr. 1: Příklad ČOV s negativním nálezem viru SARS-CoV-2 v odpadní vodě a pozitivním výskytem infikovaných osob

Obr. 2: Příklad ČOV s pozitivním nálezem viru SARS-CoV-2 v odpadní vodě a negativním výskytem infikovaných osob

Pro vývoj systému včasného varování budou nejdůležitější výsledky z lokalit, kde byly nalezeny pozitivní vzorky odpadních vod a kde byla hlášena přítomnost pozitivně testovaných osob (obr. 3). Pro správnou interpretaci těchto výsledků je třeba důrazně akceptovat rozdíly mezi typy a charakterem čistíren odpadních vod, neboť ne všechny jsou vhodné pro epidemiologické prognózy. ČOV se liší především množstvím odpadních vod, které jsou na ně přiváděny, počtem napojených obyvatel, délkou a větvením kanalizační sítě a ve většině případů zpracováním kombinace komunálních a průmyslových odpadních vod (obr. 4). U velkých ČOV je nutné brát ještě zřetel na napojování dílčích stok a odebírat vzorky z více míst.

Obr. 3: Příklad ČOV s pozitivním nálezem viru SARS-CoV-2 v odpadní vodě a pozitivním výskytem infikovaných osob

Obr. 4: Počet napojených obyvatel a množství odpadních vod u sledovaných ČOV s pozitivním nálezem viru SARS-CoV-2

Na komplikovanou interpretaci výsledků monitoringu odpadních vod ze stejných důvodů upozornili i nizozemští kolegové (https://www.waternewseurope.com/netherlands-covid-19-sewage-measurements-difficult-to-interpret/), kteří jako první přišli s myšlenkou využití odpadních vod k epidemiologickému monitoringu.

První kolo monitoringu odpadních vod, prováděné v jarní vlně epidemie nemoci COVID-19, přineslo řadu zajímavých výsledků, které budou velmi cenné a nezbytné pro další práci na tvorbě systému, jehož cílem bude včasné zachycení varovného signálu nastupující epidemiologické situace v ČR a lokalizace rizikových míst. Tento cíl, spolu s optimalizací metodiky detekce viru SARS-CoV-2 v odpadních vodách, bude v letech 2021 a 2022 řešen v rámci projektu Využití monitoringu odpadních vod jako nástroje včasného varování před vznikem epidemiologické situace, který byl podpořen ve čtvrté veřejné soutěži v rámci Programu bezpečnostního výzkumu České republiky v letech 2015 až 2022 (BV III/1-VS).

Hlavními výstupy projektu budou 2 metodiky, a to Metodika využití monitoringu rizikových biologických agens a biomarkerů v komunálních odpadních vodách jako nástroje pro včasné epidemiologické varování a Metodika detekce vybraných rizikových mikrobiologických agens pomocí PCR v odpadních vodách. Metodiky budou nabídnuty kompetentním složkám státu k využití v praxi.

Praha, 6. 11. 2020

Pracovní tým:

RNDr. Hana Mlejnková, Ph.D. – VÚV TGM, v. v. i.

Mgr. Kateřina Sovová, Ph.D. – VÚV TGM, v. v. i.

Ing. Věra Očenášková – VÚV TGM, v. v. i.

Ing. Eva Juranová – VÚV TGM, v. v. i.

Mgr. Lucie Jašíková, Ph.D. – VÚV TGM, v. v. i.

Mgr. Petra Vašíčková, Ph.D. – VÚVeL, v. v. i.

RNDr. Alena Fialová, Ph.D. – SZÚ

Monitoring výskytu koronaviru SARS-CoV-2 v odpadních vodách v České republice

Také v ČR je, díky rozsáhlé síti čistíren odpadních vod (ČOV), možné sledovat epidemiologickou situaci s využitím monitoringu odpadních vod přiváděných na ČOV. V ČR je podle informací Ministerstva zemědělství celkem 3 166 čistíren odpadních vod (9 nad 100 000 ekvivalentních obyvatel (EO), 122 nad 10 000 EO, 417 nad 2 000 EO a 2 618 do 2 000 EO). EO je uměle zavedená jednotka používaná pro návrh potřebné kapacity čistíren odpadních vod pro konkrétní území. EO představuje normovou produkci odpadní vody o objemu 150 l/den a produkci znečištění 60 g BSK₅/den. Podle počtu napojených obyvatel na ČOV by monitoringem jejich odpadních vod mohl být podchycen stav u cca 80 % obyvatel ČR, sledováním ČOV nad 10 000 EO by bylo podchyceno více než 50 % obyvatel ČR. Epidemiologické riziko by mohly představovat také volné výusti nečištěných odpadních vod do vod povrchových, kterých je u nás evidováno 4 545 (odpovídá cca 20 % obyvatel ČR).

Monitoring výskytu SARS-CoV-2 v odpadních vodách začal ve VÚV TGM, v. v. i., v polovině dubna 2020, a to ve spolupráci s analytickou laboratoří Výzkumného ústavu veterinárního lékařství, v. v. i., v Brně (VÚVeL), která se zabývá stanovením virů ve vodách, a provozovateli ČOV.

Aktuálně probíhá spolupráce s cca 20 ČOV, většina je o velikosti 10 000–100 000 EO, ale jsou zařazeny i menší ČOV do 2 000 a do 10 000 EO a také jedna ČOV nad 100 000 EO. Celkově je na tyto ČOV napojeno přes 760 000 obyvatel (cca 912 000 EO). V příslušných okresech bylo od začátku epidemie do 29. 4. 2020 hlášeno cca 1 280 nakažených osob, tj. 0,17 % napojených.

V první etapě monitoringu byly analyzovány vzorky z 20 lokalit, přítomnost specifických genových segmentů viru SARS-CoV-2 byla zjištěna na 6 ČOV, tj. 30 %. Ve vzorcích byla molekulárně-biologickou metodou PCR detekována také přítomnost dalších hygienicky významných skupin virů (norovirů a adenovirů), které byly přítomny i v čištěných odpadních vodách, což potvrzuje, že použitá metoda je dostatečně spolehlivá a citlivá.

Předběžné výsledky ukazují, že zvolený přístup cílený na průkaz výskytu viru SARS-CoV-2 v odpadních vodách je pro daný účel využitelný. Relativně nízký záchyt pozitivních nálezů ve sledovaných ČOV lze vysvětlit malým podílem nakažených ve sledovaných oblastech. Dalšími faktory ovlivňujícími úspěšnost detekce virových segmentů nukleových kyselin ve vzorcích odpadních vod mohou být možnost projevu nemoci COVID-19 bez gastrointestinálních symptomů, které jsou podle dosavadních zahraničních výzkumů doprovázeny vylučováním virových částic stolicí pouze ve 2-50 % případů, a pravděpodobný malý příspěvek virových částic od asymptomatických osob (nebylo dosud dostatečně studováno).

p>Výzkumný ústav vodohospodářský T. G. Masaryka, v. v. i., se aktuálně zapojuje do mezinárodní iniciativy zabývající se analýzou SARS-CoV-2 v odpadních vodách (SARS-CoV-2 in wastewater international collaborative study) pod záštitou asociace NORMAN, která sdružuje referenční laboratoře, výzkumná centra a organizace zabývající se monitoringem a biomonitoringem emergentních látek (nově vzniklých znečišťujících látek) v životním prostředí, a výzkumného týmu KWR Water Research Institute z Holandska. Jedním z cílů je vytvořit jednotný postup pro odběr, uchovávání a analýzu vzorků pro stanovení SARS-CoV-2 v odpadních vodách.

Náš další výzkum bude zaměřen na  ptimalizaci jednotlivých kroků metodického postupu, na hledání spodní hranice použitelnosti metody pro účelový monitoring odpadních vod, zaměřený na stanovení infekčních agens v odpadních vodách, a na návrh pro využití monitoringu jako systému včasného varování.

Praha, 12. 5. 2020